Rox?是AB公司的定量PCR平台所使用的参比染料，它可以帮助确保您获得均一的定量PCF实验结果。在定量PCF反应过程中，Rox?染料是一种非常有价值的工具，能带来以下多方面好处：校正单次反应运行中由于泡沫或蒸发/冷凝而导致的信号改变；为故障分析提供一项强有力的诊断工具：每次循环采集参比染料信号，不受PCR反应影响；均一化校正由于移液误差或蒸发所导致的批内体积差异；均一化校正批间体积差异，提供更连续一致的批间重复Ct值。
美国应用生物系统公司(Applied Biosystems)认识到均一化工具(Rox?参比染料)的好处，并在所有AB定量PCF仪上优化，以便实验人员充分利用Rox?参比染料所带来的好处。此外，所有AB生产的Real-Time PCR Master Mix试剂液都预掺入最合适量的Rox?参比染料，从而确保每次实验每个反应都获得最好的结果。
Rox?信号可以提供反应设置的信息提示：无Rox?信号，很明确地表明没有放置MasterMix试剂；异常大的信号值强度差异，提示可能放置了2倍反应体系；Rox?信号不规则变化，提示可能存在仪器故障。AB公司的技术支持在故障排除工作中总会使用RoX?参比染料，以帮助在更短时间内获得更多信息量的检测结果。Rox?均一化反应体积差异同时也证明AB定量P以下实验数据证明了Rox?参比染料在校正移液误差所导致的反应间均方差上的价值，CR仪器在使用或不使用Rox?参比染料都能获得很好的性能表现和精确性。
实验一：获得高精确性不一定需要Rox?从AB RNase P Instrument validation plate中取出反应混合液，分别移液入对应的Fast 96孔板中。在AB 7500 Fast Real-Time PCR仪上运行这块板。数据分析分别采用2组模式，一组为正常的减去Rox?参比染料，另一组将参比染料设置成“None”，从而显示使用Rox?信号均一化处理数据的价值。技术重复(24次重复)的结果显示，使用Rox?和不使用Rox?都得到了很好的结果。使用Rox?一组的Ct值SD(标准偏差),不使用Rox?一组的Ct值SD(标准偏差)(见图2)。
图2:技术重复的扩增曲线，分别采用Rox?校正(2A)和不采用Rox?校正(2B),显示重复的结果聚合紧密，散布很小。
实验二：Rox?均一化处理校正移液错误通过系统地减少从RNase P Plate中移出的样品，加入分子纯级水补齐体系，来模拟移液错误对运行精确性的影响。图2描绘了实验一中的原体积样本，以及3个移液错误重复：分别含100、200和300μl of ddH2O(样本体积相应减少)。数据分析时使用Rox?参比染料校正初始浓度差异(由移液错误导致的),得到的Ct值SD(标 准偏差)为；而不使用Rox?参比染料校正的 Ct值SD(标准偏差)为(见图3)。图3显示了技术重复与3重模拟样本移液错误(分别用100、200和300μl ddH2O替代等量样本模板)的扩增曲线。使用Rox?可以校正起样本始体积(或浓度)的轻微差异(3A),而不影响扩增效率和特异性。
实验三：使用Rox进行均一化处理以确保定量反应精确性
在实验过程中，研究人员直接从RNAse PPlate中移出反应混合液进行重复实验，并绘制标准曲线。通过比较使用Rox?和不使用Rox?分析时的精确性差异，结果显示R2值分别为和。如图4所示，实验人员对重复RNAseP标准品进行了扩增曲线的绘制。数据分析时，分别使用了Rox?(4A)和未使用RoX?(4B)的方法。结果表明，这两种方法都表现出良好的性能。
值得注意的是，当反应体系中部分样品被1卩lddH20替代时，RoX?均一化处理能够有效地校正这类小错误。然而，在分析不包含RoX?参比染料校正的情况下，各个标准组中出现了明显的点散布(见图5和表1)。通过计算重复进行RNAseP标准曲线实验的标准偏差(SD),将其与1卩l反应混合液被ddH2O取代的实验结果进行比较后发现，使用Rox?校正可以有效减少错误。
图5展示了重复RNAseP标准品以及模拟移液错误样本(1卩l反应混合液被ddH2O取代)的情况。数据分析时分别使用了Rox?(5A)和未使用RoX?(5B)的方法。证明了RoX?可以校正由轻微起始样本浓度或反应体积错误而造成的差异。表1显示了各个浓度重复反应的结果标准偏差(SD)。其中，直接从RNAse Pplate中移出反应混合液进行的重复实验，使用Rox?或不使用RoX?所得的结果具有显著差别。
