本发明属于培养基领域，具体地，涉及一种软骨祖细胞培养基及其制备方法和应用。
背景技术：
透明关节软骨作为滑膜关节的重要组成部分，具有维持骨骼的灵活性和关节的平滑性的功能。成年后，关节软骨细胞作为软骨细胞的一个亚群，缓慢维持着软骨组织的稳定。肥大软骨细胞与关节软骨细胞不同，其存在于生长板中，其功能是骨形成过程中产生新的软骨。为了治疗退行性关节疾病，用体外产生的细胞或组织替代关节软骨细胞或关节软骨为目前的主要治疗选择——全关节置换提供了一个全新的可选方案。而对于不同的细胞治疗而言，确保干细胞或祖细胞的良好来源是解决这一问题的关键。迄今为止，针对退行性关节疾病的组织工程解决方案的研究主要集中在成熟的关节软骨细胞、间充质干细胞和多能干细胞(pscs),软骨祖细胞(cpc)的相关研究较少。
PSCS为软骨细胞的产生提供了一个有吸引力的细胞来源。胚胎干细胞(escs)已经在诸多文献中证明可以通过生长因子的调控，先向中胚层细胞分化，进而分化为软骨细胞分。然而，这些分化方案所产生的软骨细胞样细胞数量非常少需要进一步改良。最新研究表明，胎儿组织是干细胞治疗的一个非常有前途的细胞来源。我们和其他人已经从许多胎儿组织中分离出多种干细胞群，包括血、肺、肝、肾、脑和脐带。与成体干细胞相比，这些胚胎来源的干细胞具有更高的增殖潜能和更强的多能性。同时，它们在致瘤性和免疫应答方面的问题也较少。
大量研究表明，许多组织中都包含有大量的干细胞组织，文献报道显示软骨组织中也包含有祖细胞样细胞。许多研究小组已经在人类、马和牛的成年关节软骨中发现鉴定了cpcs。cpcs具有多向分化潜力并且其细胞表面具有特异性标志物(例如cd105,cd166和stro-1),但总之他们起源和功能尚需进一步证明。
重要地指出由于以下原因目前分离得到的cpcs并不适合用于软骨退变治疗。首先大多数研究人员在ga≥8周时分离出hcpcs此时大多数hcpcs可能已经沿着软骨细胞谱系进展quintin等人报告说在ga14-16周分离得到的细胞可以向软骨谱系分化但不能向下分化成骨或脂肪其次由于传代限制不能产生足够数量的细胞用以进一步修复因此必须进一步研究获取能够促进cpcs长期持久自我更新的培养条件第三cpcs在体内移植成功报道尚未见
本发明的目的是克服现有技术中软骨祖细胞培养基存在的问题，提供一种新的软骨祖细胞培养基。该软骨祖细胞培养基由dmem培养基、f12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、Rock抑制剂、p38抑制剂和GSK-3α/β抑制剂组成。
上述原料的含量可以在一定范围内选择。在优选的实施方式中，为了使细胞在培养过程中能够具有更为稳定的培养环境，所述DMEM培养基与所述F12培养基的含量的体积比为1:0.5-2;且以实际所需所述培养基的总体积为基准，所述维生素C的浓度为50-200μg/ml,所述胰岛素生长因子的浓度为1-150ng/ml,所述FGF2的浓度为1-150ng/ml,所述GSK-3α/β抑制剂的浓度为1-30um,所述转铁蛋白的浓度为5-100μg/ml,所述Rock抑制剂的浓度为1-50um,所述p38抑制剂的浓度为1-20um,所述脯氨酸的浓度为0-10mm,所述丙酮酸钠的浓度为1-15mm。
本发明提供了制备髓核祖细胞培养基的方法。通过以下步骤实现：将DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、Rock抑制剂(Y27632)、GSK-3α/β抑制剂、P38MAPK抑制剂制成混合物M1;将混合物M1调节pH和渗透压得到混合物M2;将混合物M2进行灭菌处理制成软骨祖细胞培养基。
在优选的实施方式中，为了使其具有良好的调控效果，所述GSK-3α/β抑制剂选自牌号为CHIR99021的GSK-3α/β抑制剂；所述Rock抑制剂选自牌号为Y27632的Rock抑制剂；所述P38MAPK抑制剂选自牌号为SB202190的P38MAPK抑制剂。
步骤2)中调节pH的操作可以采用本领域技术人员能够理解的方式进行操作。例如，可以采用加入酸碱调节剂进行调节。在本发明的一种优选的实施方式中，步骤2)中为加入碱调节pH值。这里的碱可以选自本领域技术人员能够理解和使用的类型。例如，一种更为优选的实施方式中，所述碱选自氢氧化钠。
当然，调节后的pH值可以在一定范围内选择。例如，在一种优选的实施方式中，为了进一步保证培养环境的稳定性，混合物m2的pH值为7.3-7.5。在进一步优选的实施方式中，混合物m2的渗透压为330-360mosm/kg。
灭菌处理可以采用本领域技术人员所能够理解的方式进行操作。例如，在本发明的一种优选的实施方式中，步骤3)中的灭菌处理选自射线灭菌、干热灭菌、湿热灭菌和过滤除菌中的至少一种。在进一步优选的实施方式中，灭菌处理采用湿热灭菌。更为优选的实施方式中，灭菌处理为通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌。
本发明的另一个目的是提供所述一种软骨祖细胞培养基在培养人软骨祖细胞向多种细胞分化中的应用。通过上述技术方案，本发明提供的细胞培养基通过DMEM培养基、F12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素C、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、转铁蛋白、Rock抑制剂(Y27632)、GSK-3α/β抑制剂、P38MAPK抑制剂的协同作用以向培养细胞提供足够的营养物质和稳定的生存环境，使得培养细胞具有优异的自我更新能力。同时该培养基中未使用动物源成分，进而有效地规避了由于动物源性物质对培养细胞的自我更新及分化过程带来了不确定因素以及对培养细胞造成污染的情况的发生，并且能够在细胞治疗的过程中完全避免诱发免疫反应的发生。另外，该细胞培养基的制备方法步骤简单、原料易得，不含血清，专门用于软骨祖细胞的培养与扩增。该培养基可保持CPCs的未分化、多能状态。本发明基于前期基础，探索一个长久持续高效的CPCs培养系统，使稳定的体外繁殖的功能性的小鼠和人软骨祖细胞成为可能。
其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明：
图1-A.E11.5 SOX9 GFP+小鼠胚胎CPC分离及培养条件筛选示意图。
图1-B.在CPSR培养基中指定传代培养的MCPPC的亮场图像。比例尺=100微米。
图1-C.经过20次传代后的MCPPC数量(从10万个细胞开始)。
图1-D.SOX9-GFP细胞的流式细胞仪分析(显示细胞类型)。
图1-E(1). 对指示的表面标记物进行FACS分析。
图1-E(2). 对指示的表面标记物进行FACS分析。
图1-F.WB分析传代培养的MCPpcs中所示的蛋白。箭头表示SOX5为非特异性条带。
图1-g. 展示了RNA-seq数据的三维PCA图。不同形状代表原始细胞(正方形)、培养的cpc(三角形)。椭圆形圆圈表示三个不同的集群：培养的cpc、早期cpc和晚期cpc。
图2-a展示了不同传代胚胎培养的hcpcs的亮场图像，比例尺为100μm。
图2-b展示了从胚胎中培养的hcpcs在指定的传代时间加倍的情况。
图2-c展示了胚胎培养的hcpcs中cd29和cd44的流式细胞仪(FACS)分析。
图2-d展示了胚胎培养的hcpcs免疫荧光分析，比例尺为50μm。
图2-e展示了不同传代ipsc培养的hcpcs的亮场图像，比例尺为100μm。
图2-f展示了从ipsc中培养的hcpcs在指定的传代时间加倍的情况。
图2-g展示了ipsc培养的hcpcs免疫荧光分析，比例尺为50μm。
具体实施方式：以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。以下实施例中，DMEM培养基为Thermo Fisher Scientific公司的市售品、F12培养基为Thermo Fisher Scientific公司的市售品、脯氨酸为Sigma Aldrich公司的市售品、丙酮酸钠为Sigma Aldrich公司的市售品、维生素C为Sigma Aldrich公司的市售品、胰岛素生长因子为Thermo Fisher Scientific公司的市售品、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)为Perprotech公司的市售品、转铁蛋白为Sigma Aldrich公司的市售品、Rock抑制剂为MCE公司的市售品、P38抑制剂为Axon Medchem公司的市售品、GSK-3α/β抑制剂为Reagents Direct公司的市售品。
以下是重构后的内容：
实施例1
1)在25°C下，将dmem培养基、f12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素c、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(fgf2)、转铁蛋白、rock抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物m1;其中，dmem培养基与f12培养基的体积比为1:1,维生素c的浓度为100μg/ml,胰岛素生长因子的浓度为100ng/ml,fgf2的浓度为100ng/ml。此外，gsk-3α/β抑制剂的浓度为2um,转铁蛋白的浓度为50μg/ml,rock抑制剂的浓度为10um,p38抑制剂的浓度为2.5um,脯氨酸的浓度为0.35mm,丙酮酸钠的浓度为1mm。
2)将氢氧化钠加入至上述混合物m1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mosm/kg,制得混合物m2。
3)将上述混合物m2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基a1。
实施例2
1)在25°C下，将dmem培养基、f12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素c、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(fgf2)、转铁蛋白、rock抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物m1;其中，dmem培养基与f12培养基的体积比为1:2,维生素c的浓度为200μg/ml,胰岛素生长因子的浓度为150ng/ml,fgf2的浓度为20ng/ml。此外，gsk-3α/β抑制剂的浓度为30um,转铁蛋白的浓度为10μg/ml,rock抑制剂的浓度为50um,p38抑制剂的浓度为20um,脯氨酸的浓度为10mm,丙酮酸钠的浓度为15mm。
2)将氢氧化钠加入至上述混合物m1中以将pH调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至360mosm/kg,制得混合物m2。
3)将上述混合物m2通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基a2。
实施例3
以下是重构后的内容：
本发明提供了一种细胞培养基的制备方法。在25°C下，将dmem培养基、f12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素c、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(fgf2)、转铁蛋白、rock抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物m1;其中，dmem培养基与f12培养基的体积比为1:1.5,维生素c的浓度为150μg/ml,胰岛素生长因子的浓度为5ng/ml,fgf2的浓度为10ng/ml,所述gsk-3α/β抑制剂的浓度为20um,所述转铁蛋白的浓度为100μg/ml,所述rock抑制剂的浓度为30um,所述p38抑制剂的浓度为10um,所述脯氨酸的浓度为0mm,所述丙酮酸钠的浓度为4mm。
将氢氧化钠加入至上述混合物m1中以将ph调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mosm/kg,制得混合物m2;通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基a3。
根据实施例的不同，可以得到不同的细胞培养基a4、a5、a6、a7、a8和a9。例如：
实施例4:
在25°C下，将dmem培养基、f12培养基、脯氨酸、丙酮酸钠、维生素c、胰岛素生长因子、碱性成纤维细胞生长因子2(fgf2)、转铁蛋白、rock抑制剂、p38抑制剂和转化生长因子β信号通路抑制剂混合，制得混合物m1;其中，dmem培养基与f12培养基的体积比为1:0.5,维生素c的浓度为80μg/ml,胰岛素生长因子的浓度为80ng/ml,fgf2的浓度为50ng/ml,所述gsk-3α/β抑制剂的浓度为20um,所述转铁蛋白的浓度为75μg/ml,所述rock抑制剂的浓度为10um,所述p38抑制剂的浓度为1um,所述脯氨酸的浓度为5mm,所述丙酮酸钠的浓度为10mm。将氢氧化钠加入至上述混合物m1中以将ph调至7.4后，再加入氯化钠调节渗透压至340mosm/kg,制得混合物m2。通过具有0.2μm直径微孔的滤膜过滤灭菌制得细胞培养基a4。
实施例5:
按照实施例4的方法进行，不同之处在于步骤1)中未使用维生素c,制得细胞培养基d1。
实施例6:
按照实施例4的方法进行，不同之处在于步骤1)中未使用胰岛素生长因子，制得细胞培养基d2。
实施例7:
按照实施例4的方法进行，不同之处在于步骤1)中未使用fgf2,制得细胞培养基d3。
实施例8:
按照实施例4的方法进行，不同之处在于步骤1)中未使用gsk-3α/β抑制剂，制得细胞培养基d4。
实施例9:
实施例10
按照实施例1的方法进行，不同的是，在步骤1中不加入转铁蛋白，制得细胞培养基d6。
实施例11
按照实施例1的方法进行，不同的是，在步骤1中不加入p38抑制剂，制得细胞培养基d7。
实施例12
按照实施例1的方法进行，不同的是，在步骤1中不加入脯氨酸，制得细胞培养基d8。
实施例13
按照实施例1的方法进行，不同的是，在步骤1中不加入丙酮酸钠，制得细胞培养基d9。
实施例14(应用例1)
首先将培养皿用matrigel基质胶进行包被(当然，使用玻璃连粘蛋白vitronection亦可)2h;然后在37°C的水浴中复苏冻存的小鼠软骨祖细胞，并将该细胞接种至上述a1培养基中，在37°C、5%co2下进行培养，并且每天更换培养基，直至多能干细胞增殖到80%融合度(confluency)时，接着以0.5mmol/l的edta(ph=8.0,渗透压(osmolarity)=340mosm)进行消化传代以保持小鼠软骨祖细胞细胞团的状态。当需要单细胞传代时，应用trypsin酶(当然trypleexpress酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为y-27632的rock抑制剂(工作浓度为10μmol/l,提高细胞的存活率)培养24h。
去除培养基，以pbs缓冲溶液清洗3次，接着以0.5mmol/l的edta(ph=8.0,渗透压(osmolarity)=340mosm)消化5min,吸去edta,加入a1培养基轻轻吹打3到5次，以保持小鼠软骨祖细胞细胞团的状态，以面积比1:8传至新的用matrigel基质胶或者vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基a1在37°C、5%co2下培养，每天更换培养基，当细胞融合度达到80%时，得到细胞b1。
实施例15(检测例1)
首先，用0.5mmol/l的edta(ph=8.0,渗透压(osmolarity)=340mosm)消化上述细胞b1至细胞团状态，计数，取一部分往下传代(即扩增)。传代18次。结果见图1-b。
其中：图1-b是在cpsr培养基中指定传代培养的mcpc的亮场图像。其中passage3是扩增第3代，passage12是扩增第12代，passage18是扩增第18代。
本发明提供了一种用于稳定培养小鼠软骨祖细胞的方法，以便于进行后续的实验研究。通过应用例1和检测例1的操作方法，可以得出结论，培养基a2、a3和a4能够稳定地培养小鼠软骨祖细胞。然而，当将细胞培养基替换为d1-d10时，结果显示这些培养基无法成功地培养小鼠软骨祖细胞。
为了进一步验证这一结论，实施例17采用了应用例1和检测例1的方法的不同之处，即将细胞培养基替换为d1-d10。实验结果显示，细胞培养基d1-d10无法成功培养小鼠软骨祖细胞。这表明在本发明所提供的细胞培养体系下，某些特定的细胞培养基可能无法满足小鼠软骨祖细胞的生长需求。
实施例18是本发明的一个应用例，其主要目的是在特定条件下稳定地培养小鼠软骨祖细胞，以便于进行后续的实验研究。具体操作步骤如下：
1. 将培养皿用matrigel基质胶进行包被(当然，使用玻璃连粘蛋白vitronection亦可),包被时间为2小时；
2. 在37°C的水浴中复苏冻存的人软骨祖细胞，并将该细胞接种至上述a1培养基中；
3. 在37°C、5%co2下进行培养，并且每天更换培养基，直至软骨祖细胞增殖到80%融合度(confluency)时；
4. 接着以0.5mmol/l的edta(ph=8.0,渗透压(osmolarity)=340mosm)进行消化传代以保持人软骨祖细胞细胞团的状态；
5. 当需要单细胞传代时，应用trypsin酶(当然trypleexpress酶也可以)消化，并向培养基中加入牌号为y-27632的rock抑制剂(工作浓度为10μmol/l,提高细胞的存活率)培养24小时。
通过以上实施例可以得出结论，本发明所提供的细胞培养体系可以稳定地培养小鼠软骨祖细胞，并且在特定条件下可以进行有效的传代和消化。这些结果为后续的实验研究提供了有力的支持。
本发明提供了一种优选的培养人软骨祖细胞的方法，以及用于检测软骨祖细胞增殖能力的实验。具体实施方式包括以下步骤：
1)将人软骨祖细胞从胚胎中提取出来，并进行体外培养。
2)去除培养基，以PBS缓冲溶液清洗3次，接着以0.5mmol/L的EDTA(pH=8.0,渗透压(osmolarity)=340mosm)消化5分钟，吸去EDTA,加入A1培养基轻轻吹打3到5次，以保持人软骨祖细胞细胞团的状态。
3)将细胞传至新的用Matrigel基质胶或者Vitronectin包被的培养皿中，加入细胞培养基A1在37°C、5%CO2下培养，每天更换培养基。当细胞融合度达到80%时，得到细胞B1。
4)对于第1-9代的细胞B1,进行扩增18次；对于第10-19代的细胞B1,进行扩增3次。扩增后的细胞可以用于后续的实验。
5)根据需要，可以将扩增后的细胞传代至第20-X代。
6)通过流式细胞仪(FACS)分析，验证本发明提供的细胞培养基是否能够成功分离传代(p14)并保持向多种细胞分化的能力。
7)通过免疫荧光分析，验证由IPSCS培养出的HCPCS在本发明提供的细胞培养基这一培养体系下，增殖15代后仍有良好的软骨祖细胞形态。
8)根据需要，可以将扩增后的细胞传代至第20-X代。
9)根据应用例2和检测例2的方法进行操作，不同的是，将细胞培养基分别替换为D1-D9。结果显示，细胞培养基D1-D9无法成功培养人软骨祖细胞。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
此外，值得注意的是，在描述本发明具体实施方式时所列出的各个技术特征可以在不产生矛盾的情况下进行任意组合。为了避免冗余和不必要的解释，本文不再详细说明各种可能的组合方式。
同时，各种不同的本发明实施方式之间也可以根据需要进行灵活组合。只要这种组合不违背本发明的核心思想，那么它们同样应该被视为本发明所公开的内容。因此，在实际应用中，可以根据具体需求选择合适的实施方式或对现有实施方式进行组合创新，以实现更优的效果。总之，本发明的创造性体现在其开放性和多样性上，为用户提供了更多的选择和发挥空间。
